マウス脳内におけるGABA放出の概日リズム

γ-アミノ酪酸（Gamma Amino Butyric Acid, GABA）は、中枢神経系における重要な抑制性の神経伝達物質です。概日時計の中枢であるSCNにおいてもその大部分がGABA作動性の神経細胞で構成されています。 SCNの培養細胞にGABAの慢性投与を行うと細胞同士の時計が同期されることや(Leu C, 2000)、SCN特異的にGABAを欠損させたマウスにおいて自発行動量が低下し概日リズムが減衰することが報告されており(Ono D, 2019)、SCNにおいてGABAは概日時計の調節に重要な役割を持つことが示唆されています。しかし、その放出量の概日変動については未だに知られていません。 そこで本研究では、in vivoマイクロダイアリシス法を用いてマウスのSCN内におけるGABAの細胞外濃度を一定時間毎に計測・分析することで、概日リズムの有無を明らかにしていきます。他の神経伝達物質の放出リズムや神経発火リズム、SCN以外の脳部位のGABA放出リズムなどと比較することによって、SCNにおけるGABAの機能解明の一助となることを期待しています。

マウス脳内におけるモノアミン放出の概日リズム

　モノアミンとはドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、ヒスタミンなどの神経伝達物質の総称であり、脳幹や視床下部において睡眠・覚醒状態に強く影響を与えることが知られています。 神経伝達物質はアミノ酸系とペプチド系、モノアミン系に分かれており、SCNにおいて主要なアミノ酸系神経伝達物質であるグルタミン酸やアスパラギン酸、ペプチド系であるバソプレシン（arginine vasopressin: AVP）や腸管作用性ペプチド（vasoactive intestinal polypeptide: VIP）の概日リズムは研究されています。しかし、モノアミンのSCNにおける概日時計への影響は未解明な部分が多く、前述したGABAと同様、SCNにおける放出量の概日リズムは知られていません。そこで本研究では、in vivoマイクロダイアリシス法を用いてマウスのSCN内におけるモノアミンの細胞外濃度を計測、分析していきます。GABAや他の神経伝達物質のリズムと比較することで、概日リズムの有無やSCNにおけるモノアミンの機能を検討していきます。

雌性生殖機能における視交叉上核AVPニューロンの役割

1950年代初頭にEverettとSawyerが提案した排卵を誘発するLHサージを引き起こすためにcritical window（臨界時間枠）という時間帯（ZT9-11）に何らかの神経シグナルが必要であるということが分かっています。また、排卵に必要なGnRHサージを生む領域である視床下部の前腹側室周囲核(AVPV)のキスペプチンニューロンに、SCN内のAVPニューロンが投射していることが報告された。私たちはそれらの仮説に基づいて、光遺伝学的手法を用いて、特異的にAVP細胞をその時間帯に抑制することによって、AVP細胞の雌性生殖機能における役割を検討しています。　

　私たちはこれまでに、critical windowの時間帯にAVPニューロンを抑制すると、通常4日間で回復する性周期が延長することが観察されました。この結果から、LHサージをはじめとする雌性生殖機能にSCN内のAVPニューロンが重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されました。現在は、同じ方法を用いてVIPニューロンの役割も検討しています。

概日時計中枢（SCN）における加齢の影響

生物が持つ概日リズムは、加齢に伴って変化が見られるようになることが分かっています。概日時計中枢であるSCNにおいては、加齢に伴って神経出力が弱まることが報告されていますが、in vitroの研究において老齢マウスのSCNリズム機構は正常に機能することが示され、in vivoにおける研究との間で矛盾が生じています。 そこで、本研究ではin vivoにおけるSCNリズム機構について調査することを目的に、時計遺伝子Per1のSCN内での発現リズムをin vivoで測定し、老齢マウスと若齢マウスで比較していきます。 加齢と時計遺伝子の関係性を解明することで、老化の予防や老化症状の改善の一助となることを期待しています。

ウルトラディアン温度変化による概日中枢時計安定化機構の解明

　Per1欠損マウスでは、野生型と同様に輪回しリズムは夜に高く、日中に低くなっており、概日リズムを示します。また、Per１欠損マウスにおける生体内の多神経発火活動（MUA）リズムは概日リズムが認められます。（takasu et al.,2013）しかし、Per1⁻/⁻/PER2::LUCマウスのSCNスライスでは野生型と異なり、概日リズムを示しませんでした。(Pendergast et al.,2009)　つまり、in vivo では概日リズムを示すのに対し、in vitroでは概日リズムを示しませんでした。 SCN周辺の脳温度を計測したところ、約2.5時間周期(ウルトラディアンリズム)で温度変化が観察されました。そこで、本研究では、in vivo とin vitro の矛盾はウルトラディアン温度リズムの違いであると考えており、SCNスライスに温度変化を与えると概日リズムが認められるのかを研究しています。

時計遺伝子欠損マウス（Pers TKO）における概日リズム発振機構の解明

現在、概日時計はPeriodをはじめとする時計遺伝子による転写と翻訳のフィードバックループによって生み出されると考えられています。哺乳類は３つのPeriod遺伝子（Per1, Per2, Per3）を持っていることが知られ、この３つをすべて欠失させたマウス（Pers TKOマウス）では概日時計は働かないと考えられています。しかし、概日行動リズムが消失したPers TKOマウスに、3時間の光刺激を与えると概日行動リズムが数日間現れることから、Per遺伝子を含む時計遺伝子のフィードバックループによらない概日時計機構があることが示唆されています。 そこで、本研究ではPers TKOマウスの新生児を用い、SCNのスライス培養および分散培養下での神経発火活動リズムを計測することで、このSCNにおける既知の時計遺伝子のフィードバックループによらない概日時計機構の存在を検討します。